Práctica LXIV: 22/05/2015

Prueba cruzada mayor

Fundamento:

Enfrentar el suero del receptor con los hematíes del donante, primero en medio salino, posteriormente en medio albuminoso, y por último frente al suero de coombs. Así detectaremos los anticuerpos que se hayan quedado fijados a la membrana eritrocitaria.

Material:

- Tubos de hemólisis

- Centrifuga

- Baño de agua

- Pipetas Pasteur

- Gradilla

- Reloj

Reactivos:

- Solución salina fisiológica

- Albúmina bovina

- Suero de coombs

Muestra:

- Suero del receptor obtenido de sangre coagulada y libre de hemólisis

- Suspensión de hematíes al 2% o al 5% del donante

Desarrollo:

1º. En un tubo de hemólisis depositamos una gota de suspensión del donante y 2 gotas del suero del receptor

2º. Mezclamos suavemente y dejamos a temperatura ambiente durante 2-3 minutos

3º. Centrifugamos a 3000rpm 1 minuto

4º. Leemos el resultado obtenido si da positivo no se sigue con la practica

5º. Añadimos 3 gotas al tubo de albúmina

6º. Mezclamos e incubamos a 37º C unos 30 minutos

7º. Centrifugamos a 3000rpm durante 1 minuto

8º. Leemos el resultado si da positivo no seguimos

9º. Lavamos 3 veces los hematíes con solución salina

10º. Añadimos una gota de suero de coombs

11º. Centrifugamos a 1000rpm durante 2 minutos

12º.  Leemos los resultados

Resultados:

La ausencia de aglutinación en todos los pasos indica que las sangres son compatibles y se puede realizar la transfusión.

Si aglutina en cualquiera de las fases la prueba indica incompatibilidad, también la hemólisis indica incompatibilidad.

Ejercicios:

1.) ¿Qué se enfrenta en la prueba cruzada mayor?

Suero del receptor contra suspensión de hematíes del donante

2.) ¿Cuándo se debe realizar la prueba cruzada menor?

Cuando se transfunde una gran cantidad de plasma

3.) ¿Por qué debemos realizar la prueba en medio salino y albuminoideo?

Para estar seguro de que se puede transfundir esa sangre al 100%

4.) ¿Qué pone de manifiesto el suero antiglobulina de coombs?

Los eritrocitos de la membrana de los hematíes

Práctica LV: 22/04/2015

Determinación celular en porta

Fundamento:

Observar la aglutinación de los hematíes enfrentados a una serie de antisueros conocidos y de reconocida eficacia, para determinar el grupo ABO del individuo

Material:

- Portaobjetos

- Rotulador de vidrio

- Pipeta Pasteur

- Palillos mezcladores

- Reloj

Reactivos:

- Suero anti-A

- Suero anti-B

Muestra:

- Sangre capilar o total anticoagulada, nitratada u oxalatada

Desarrollo:

1º. Dividir un porta en dos secciones con las letras A y B

2º. Depositar una gota de sangre en cada lado

3º. Depositar una gota de suero anti-A en A y una gota de suero anti-B en B

4º. Mezclamos con palillos diferentes cada sección

5º. Hacer oscilar hacia delante y hacia atrás el porta 2 minutos

6º. Observar la presencia o ausencia de aglutinación

Resultados:

Según donde de aglutinación o donde no se le asignara un grupo eritrocitario al paciente:

Si da positivo en A su grupo será A, si da positivo en B su grupo será B, si da positivo en ambos A y B su grupo será AB y si por el contrario no hay aglutinación en ninguno su grupo será 0.

En caso de que el grupo sea A los hematíes deberán ser ensayados de nuevo con lectinas anti-A1 de forma que si se produce aglutinación, el paciente será A1, si no se produce aglutinación su grupo será A2.

Ejercicios:

1.) ¿Qué tipo de técnica se emplea en este análisis?

Celular

2.) ¿Qué muestra utilizamos?

Sangre capilar o total anticoagulada

3.) ¿Cómo se ve la aglutinación positiva?

Grumos rojos que flotan en líquido claro

4.) ¿Qué debemos hacer si el grupo obtenido es A?

Determinar si es A1 o A2

Práctica LIV: 22/05/2015

Determinación rápida de hemoglobina 

Fundamento:

 Determinar la concentración de hemoglobina justo antes de realizar una donación.

Material:

 - Lanceta

 - Vaso de precipitado de 50 ml

Reactivos:

- Solución de sulfato de cobre a una densidad de 1,052 g/dl

Muestra:

- Sangre capilar adecuadamente recogida

Desarrollo:

   1º. Disponer la solución de sulfato de cobre en un vaso de precipitado.

2º. Recoger una gota de la sangre problema.

3º. Dejar caer la gota con algo de impulso sobre la solución.

Resultados:

   Si la gota de sangre es más densa que la solución cae a través de ella pero si es menos densa no cae al fondo del vaso.

   Una gota de sangre con más de 12 g/dl de Hb tiene mayor densidad que 1,052 g/cm3

Si la sangre del paciente tiene esa densidad el paciente puede donar sangre, en caso contrario la donación no puede ser efectuada.

Ejercicios:

1.) ¿Cuál es el mínimo de hemoglobina que debe tener una mujer antes de la donación? 

12 g/dl

Práctica LX: 05/05/2015

 Determinación del grupo Rh en tubo.

Fundamento:

       

 La detección del antígeno D sobre la superficie de los hematíes problema, empleando como reactivo un suero monoclonal humano que contiene anticuerpos anti-  D.

Material:

- Papel de filtro.

- Bata y guantes.

- Centrífuga.

- Rotulador de vidrio.

- Gradilla.

- Pipetas Pasteur de vidrio.

- Tubos de centrífuga.

- Parafilm.

- Vasos de precipitado.

- Pipetas y micropipetas.

- Puntas de pipetas.

- Reloj.

Muestra:

  - Muestra de hematíes suspendida al 5%

Reactivos:

- Suero anti-D

- Albúmina bovina al 30 %.

- Suero fisiológico.

Desarrollo:

1º. Lavar los hematíes tres veces, por 1 ml de hematíes - 3 ml de suero, a 2500 rpm durante 3 minutos.

2º. Preparar la suspensión al 5% de los hematíes, para lo que utilizamos 0,1 ml de hematíes lavados y 1,9 ml de suero.

3º. En dos tubos, verter una gota de suspensión en cada uno y una gota de suero anti-D en un tubo y otra gota de albúmina en el otro.

4º. Centrifugar  durante 1 minuto a 1000 rpm.

5º. Golpear suavemente cuando termine de centrifugar.

         Resultados:

   Se considera aglutinación positiva si se forman grumos de color rojo en un líquido claro. Si, por el contrario, se resuspenden de forma homogénea los hematíes, decimos que la aglutinación es negativa.

         Ejercicios:

1.) ¿Por qué utilizamos el control de albúmina?

Para un control negativo

2.) ¿Qué ocurre si no aparece aglutinación en el tubo D?

    Que presenta un Rh negativo

3.) ¿Qué debemos detectar mediante un Coombs indirecto?

    Si el paciente posee Du

4.) ¿Cómo se prepara la muestra problema?

  Se realiza una suspensión al 5 % de hematíes, realizando una serie de lavados.

Práctica LXII 20/05/20

Determinación de un Du

Fundamento:

 El Du es un antígeno D débil que no se pone de manifiesto en las pruebas normales de la determinación del Rh. Por ello hay que sensibilizar los hematíes problema con suero anti-D y posteriormente enfrentarlos a suero de coombs.

Esta prueba es de coombs indirecta.

Material:

- tubos de hemólisis

- centrífuga

- pipetas Pasteur

- gradilla

- baño de agua

- reloj

Reactivos:

- suero anti-D

- suero de coombs

- solución salina fisiológica

Muestra:

- hematíes de sangre problema suspendidos al 5%

Desarrollo:

1º. En un tubo de hemólisis colocamos una gota de suero anti-D y una de suspensión de hematíes

2º. Mezclamos e incubamos a 37º C durante 30 minutos

3º. Lavamos los hematíes 3 veces con solución salina y decantamos completamente en el último lavado

4º. Añadimos una gota de coombs y mezclamos suavemente

5º. Centrifugamos a 1000 rpm durante 1 minuto

Resultados:

Observamos la aparición o no de aglutinación mediante leves golpes en el fondo del tubo.

Si hay aglutinación el resultado es positivo e indica que en la membrana de los hematíes hay antígeno Du y se clasifica la sangre como Rh positivo, por el contrario si no existe aglutinación la sangre se clasifica como Rh negativo.

Ejercicios:

1.) ¿Qué contiene el suero de Coombs?   

     Suero antiglobulina humana de conejo.

2.) ¿Qué se detecta con la prueba directa?

   Evita falsos positivos y se realiza como control negativo.

3.) ¿ Qué podemos detectar con la prueba indirecta?

     La existencia de antígeno Du en la membrana de los hematíes.

4.) ¿Qué buscamos en la sangre del paciente?

   Poner de manifiesto el antígeno Du.

5.) ¿Qué ocurre si el control es positivo?

   No puede, el resultado seria erróneo.

Práctica LVI 23/04/2015

Determinación celular en tubo

Fundamento:

Los hematíes problema contienen sustancias antigénicas del sistema ABO y se enfrentan a sueros conocidos que poseen anticuerpos frente a esos antígenos. El resultado final es la presencia o no de aglutinación en los hematíes reaccionantes.

Material:

- Tubos de centrífuga

- Rotulador de vidrio

- Pipetas Pasteur

- Centrífuga

- Gradillas

Reactivos:

- Suero anti-A

- Suero anti-B

- Suero anti-AB

- Solución salina fisiológica

Muestra:

- Sangre total anticoagulada.

Desarrollo:

1º. Haremos un lavado de los hematíes problema. Rotulamos un tubo de centrífuga y añadimos 1 ml de la muestra de sangre. Completamos el tubo con solución salina y agitamos para suspender los hematíes. Centrifugamos 4 minutos a 2000 rpm y decantamos el sobrenadante.

2º. A los hematíes del tubo les añadimos una cantidad suficiente de solución salina como para obtener una suspensión al 2%.

3º. Rotulamos tres tubos de ensayo con las letras A, B y AB

4º. Añadimos a cada tubo una gota de la suspensión de hematíes al 2%.

5º. Añadimos dos gotas de suero anti-A en el tubo A, dos gotas de anti-B al tubo B y dos gotas de anti-AB al tubo AB.

6º. Centrifugamos todos los tubos durante 1 minuto a 1000 rpm.

Resultados:

Después de la centrifugación, golpeamos suavemente el fondo de cada tubo para observar macroscópicamente del sedimento, la presencia o ausencia de aglutinación.

Reacción negativa: Los hematíes se resuspenden homogéneamente.

Reacción positiva: Se observa un botón de hematíes que permanecen unidos una vez desprendido el sedimento.

Interpretación:

Es importante destacar que los restos de detergente o sustancias extrañas en los tubos pueden ocasionar falsos negativos.

También pueden darse falsos positivos, por dos motivos:

Por aglutinación no específica y por el fenómeno de Rouleaux, que este consiste en una agrupación no específica de hematíes.

Ejercicios:

1.) ¿Qué tipo de técnica inmunológica se emplea en este análisis?

Una suspensión de hematíes

2.) ¿A qué concentración se prepara la suspensión de hematíes problema?

A una suspensión de 2%

3.) ¿Cómo se ve una aglutinación positiva?

Se observa un botón de hematíes que permanecen unidos una vez desprendido el sedimento.

4.) ¿A qué se debe el fenómeno de Rouleaux?

A una agrupación no específica de hematíes, que adoptan una imagen de pilas de monedas.

5.) ¿Cómo se pueden evitar los falsos positivos?

Con el lavado previo de los hematíes problema. 

Práctica LIX 5/05/2015

Determinación del grupo Rh en porta

Fundamento:

La técnica está basada en la detección del antígeno D sobre la superficie de los hematíes problema, empleado como reactivo un suero monoclonal humano que contiene anticuerpos anti-D.

En el caso de que los hematíes contentan el antígeno D se producirá un aglutinación que puede observarse a simple vista.

Material:

- Portaobjetos

- Pipetas Pasteur

- Rotulador

- Palillos agitadores

- Visualizador luminoso

Reactivos:

- Suero anti-D

- Albúmina bovina al 30%

Muestra:

- Sangre total anticoagulada

Desarrollo:

1º. Dividir el portaobjetos en dos secciones con el rotulador de vidrio y marcar una con la letra S (suero) y otra con la letra A (albúmina)

2º. En la sección S colocamos dos gotas del suero anti-D, y en la sección A ponemos dos gotas de albúmina bovina al 30%.

3º. Depositamos una gota de sangre en cada una de las secciones y mezclamos con palillos distintos.

4º. Colocamos el porta sobre el visualizador previamente calentado, y lo balanceamos para favorecer la mezcla de sangre y reactivos.

Resultados:

Esperamos dos minutos antes de dar el resultado de la prueba.

Aglutinación positiva: Aparición de grumos rojos sobre un fondo claro.

Aglutinación negativa: La mezcla da lugar a una suspensión homogénea de los hematíes.

Interpretación:

Los resultados se interpretan según el siguiente cuadro:

Sección S	Sección A	Interpretación
+	-	Rh positivo
-	-	Rh negativo
+	+	¿?

+ = Aglutinación positiva

- = Aglutinación negativa

¿? = No se puede interpretar

Ejercicios:

1.) ¿Qué tipo de muestra empleamos en esta técnica?

Sangre total anticoagulada

2.) ¿Para qué se utiliza el visualizador?

Para poder observar mejor la aglutinación.

3.) ¿Qué puede dar lugar a las falsas aglutinaciones?

Pequeños coágulos de fibrina presentes en la muestra.

4.) ¿Qué ocurre si aglutina la sección A?

Que obtenemos un Rh positivo.

Práctica LXI 7/05/2015

Determinación del fenotipo y genotipo de Rh

Fundamento:

Podemos investigar el genotipo del sistema Rh enfrentando los hematíes problema a distintos antisueros dirigidos contra los antígenos que componen el sistema Rh. La existencia o no de estos antígenos en la superficie de hematíes se detecta por una reacción de aglutinación.

Material:

- Tubos de centrífuga

- Centrífuga

- Rotulador

- Pipetas Pasteur desechables

- Gradilla

Reactivos:

- Suero anti-D

- Suero anti-E

- Suero anti-C

- Suero anti-e

- Suero anti-c

- Solución salina fisiológica

Muestra:

- Suspensión de hematíes lavados al 5% en solución salina fisiológica.

Desarrollo:

1º. Procedemos al lavado de hematíes y a preparar su suspensión al 5%.

2º. Rotulamos cinco tubos de centrífuga, cada uno con la letra D, E, C, c y e.

3º. En cada tubo añadimos una gota del antisuero correspondiente y una gota de la suspensión de hematíes al 5%.

4º. Homogenizamos suavemente, centrifugamos todos los tubos durante un minuto a 1000 rpm.

Resultados:

Golpeamos suavemente en el fondo de los tubos para despegar el sedimento hemático.

El resultado positivo es la presencia de aglutinación, y se observa con la presencia de grumos rojos sobre un fondo claro.

La ausencia de aglutinación es un resultado negativo, y se observa como la suspensión homogénea de los hematíes en un líquido rojizo.

Interpretación:

Un resultado positivo indica la presencia del antígeno del sistema Rh buscado en ese tubo. El resultado negativo indica lo contrario.

Los cinco resultados obtenidos expresan el fenotipo de la sangre analizada y se comparan con los contenidos en la tabla de fenotipos y genotipos del sistema Rh que hay a continuación:

Ejercicios:

1.) ¿Qué antisueros se utilizan en esta técnica?

D, E , C, e y c.

2.) ¿Qué expresan los cinco resultados obtenidos?

Expresan el fenotipo de la sangre analizada

3.) Si la sangre es Rh +, ¿puede determinarse exactamente su genotipo con respecto al sistema Rh?

No porque existen varios genotipos posibles que dan lugar al fenotipo previamente detectado.

4.) Si los resultados obtenidos som: D-, C-, E+, c+, y e- ; ¿cuál es el genotipo posible de esta sangre?

dcE/dcE

Práctica LVII 27/04/2015

Determinación sérica del grupo ABO

Fundamento:

El suero de un individuo sólo debe contener anticuerpos frente a antígenos que no están presentes en sus propios hematíes. Por ello, al hacer reaccionar este suero con hematíes conocidos del grupo A y del grupo B sólo producirá aglutinación en el caso de ser enfrentado a eritrocitos con antígenos distintos a los de sus propios hematíes.

Material:

- Tubos de centrífuga

- Pipetas Pasteur

- Baño de agua

- Centrífuga

- Reloj

- Rotulador de vidrio

- Gradilla

Reactivos:

- Hematíes del grupo A1

- Hematíes del grupo A2

- Hematíes del grupo B

- Hematíes del grupo 0

- Hematíes de la sangre problema

Muestra:

- Plasma obtenido de la sangre problema

Desarrollo:

1º. Para evitar falsos negativos se inactiva previa de la muestra. Se hace manteniendo el plasma en un baño de agua a 56º durante 10 minutos.

2º. Lavamos tres veces los hematíes propios de la sangre problema con solución salina. Posteriormente preparamos una suspensión de estos hematíes al 5% en solución salina.

3º. Rotulamos un tubo de centrífuga con la letra A1, otro con A2, otro con B, otro con 0 y otro con C.

4º. Añadimos a cada tubo dos gotas del suero problema inactivado.

5º. Depositamos una gota de la suspensión de hematíes que se corresponda con la letra del tubo rotulado.

6º. Agitamos suavemente y centrifugamos a 1000 rpm durante 1 minuto.

Resultado:

Golpeamos suavemente el extremo inferior de los tubos para despegar el sedimento hemático.

Si aparecen unos grumos rojos flotando en un líquido claro, indica que existe aglutinación.

Interpretación:

Tubo A1	Tubo A2	Tubo B	Tubo 0	Tubo C	Ac presentes en suero	Grupo eritrocitario
-	-	+	-	-	Anti-B	A1
-o+*	-	+	-	-	Anti-B y Anti-A1*	A2
+	+	-	-	-	Anti-A	B
+	+	+	-	-	Anti-A y Anti-B	0
-	-	-	-	-	Ninguno	A1B
-o+	-	-	-	-	Ninguno o Anti-A1	A2B
+	+	+	+	+	Autoanticuerpos	Ininterpretable

+ = Aglutinación

- = No aglutinación

* = Este anti-A1 se encuentra solo en el 2% de los individuos A2.

Ejercicios:

1.) ¿Qué son los hematíes tipados?
La técnica que realizamos con los hematíes
2.) ¿A qué dilución empleamos los hematíes del paciente?
Al 5%
3.) ¿Qué clase de muestra se emplea en esta técnica?
Suero obtenido mediante coagulación de la sangre.
4.) ¿Qué ocurre cuando el tubo C presenta aglutinación?

Que los anticuerpos presentes en el suero presentan autoanticuerpos.