Práctica LVII 27/04/2015

Determinación sérica del grupo ABO

Fundamento:

El suero de un individuo sólo debe contener anticuerpos frente a antígenos que no están presentes en sus propios hematíes. Por ello, al hacer reaccionar este suero con hematíes conocidos del grupo A y del grupo B sólo producirá aglutinación en el caso de ser enfrentado a eritrocitos con antígenos distintos a los de sus propios hematíes.

Material:

- Tubos de centrífuga

- Pipetas Pasteur

- Baño de agua

- Centrífuga

- Reloj

- Rotulador de vidrio

- Gradilla

Reactivos:

- Hematíes del grupo A1

- Hematíes del grupo A2

- Hematíes del grupo B

- Hematíes del grupo 0

- Hematíes de la sangre problema

Muestra:

- Plasma obtenido de la sangre problema

Desarrollo:

1º. Para evitar falsos negativos se inactiva previa de la muestra. Se hace manteniendo el plasma en un baño de agua a 56º durante 10 minutos.

2º. Lavamos tres veces los hematíes propios de la sangre problema con solución salina. Posteriormente preparamos una suspensión de estos hematíes al 5% en solución salina.

3º. Rotulamos un tubo de centrífuga con la letra A1, otro con A2, otro con B, otro con 0 y otro con C.

4º. Añadimos a cada tubo dos gotas del suero problema inactivado.

5º. Depositamos una gota de la suspensión de hematíes que se corresponda con la letra del tubo rotulado.

6º. Agitamos suavemente y centrifugamos a 1000 rpm durante 1 minuto.

Resultado:

Golpeamos suavemente el extremo inferior de los tubos para despegar el sedimento hemático.

Si aparecen unos grumos rojos flotando en un líquido claro, indica que existe aglutinación.

Interpretación:

Tubo A1	Tubo A2	Tubo B	Tubo 0	Tubo C	Ac presentes en suero	Grupo eritrocitario
-	-	+	-	-	Anti-B	A1
-o+*	-	+	-	-	Anti-B y Anti-A1*	A2
+	+	-	-	-	Anti-A	B
+	+	+	-	-	Anti-A y Anti-B	0
-	-	-	-	-	Ninguno	A1B
-o+	-	-	-	-	Ninguno o Anti-A1	A2B
+	+	+	+	+	Autoanticuerpos	Ininterpretable

+ = Aglutinación

- = No aglutinación

* = Este anti-A1 se encuentra solo en el 2% de los individuos A2.

Ejercicios:

1.) ¿Qué son los hematíes tipados?
La técnica que realizamos con los hematíes
2.) ¿A qué dilución empleamos los hematíes del paciente?
Al 5%
3.) ¿Qué clase de muestra se emplea en esta técnica?
Suero obtenido mediante coagulación de la sangre.
4.) ¿Qué ocurre cuando el tubo C presenta aglutinación?

Que los anticuerpos presentes en el suero presentan autoanticuerpos.

Determinación cuantitativa del fibrinógeno

Fecha: 09/03/15

* Fundamento:

El tiempo de formación del coágulo es inversamente proporcional a la concentración de fibrinógeno presente en la muestra de plasma.

El fibrinógeno en presencia de un exceso de trombina se transforma en fibrina.

* Material:

- Cubetas de coagulómetro

- Coagulómetro

- Pipeta graduada de 5 ml

- Micropipeta

- 6 tubos de ensayo

* Reactivos:

- Trombina bovina (R1)

- Tampón imidazol (R2)

- Solución caolín (R3)

* Muestra:

- Plasma pobre en plaquetas (PPP).

* Desarrollo:

1º. Se reconstituye R1 con 2 ml de agua destilada

2º. Se prepara una disolución 1/10 de la muestra y R2: 50 microlitros de muestra +450 microlitros tampón imidazol

3º. En 5 tubos de ensayo se introducen las siguientes diluciones de calibrador:

Dilución del calibrador	1/40	1/30	1/20	1/10	1/5
Tampón Imidazol	3.9	2.9	1.9	0.9	0.4
Coagulation CAL	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1
Factor	10/40	10/30	10/20	10/10	10/5
Concentración (mg/dL)	59,75	78,87	119,5	239	478

4º. El contenido de los tubos se introduce en 5 cubetas de coagulómetro con varillas 200 uL en cada una y se le añade 20 uL de R3

5º. Atemperar en la placa calefactora del coagulómetro durante 3 minutos

6º. Introducir sucesivamente las cubetas en la celda de medida y añadir 100 uLde R1 para que empiece la coagulación.

* Interpretación:

Esta determinación detecta déficits en los factores de coagulación de la vía común y fallos en la fibrinólisis.

Se realiza una curva con los tiempos de coagulación y las concentraciones para detectar si los tiempos se encuentran en la curva lineal si están fuera indica que tiene un tiempo alargado de coagulación.

Recuento frotis sanguíneo

Fecha: 08/01/15

* Fundamento:

El recuento de plaquetas consiste en la determinación del número de trombocitos presentes en un volumen determinado de sangre (generalmente 1mm cúbico)

El recuento de plaquetas mediante el examen de frotis sanguíneo permite el estudio de la morfología de los trombocitos.

* Material:

- Microscopio

- Papel

- Bolígrafo

* Reactivos:

- Líquido de inmersión

* Muestra:

- Extensión de sangre problema coloreada con un método de tinción tradicional (panóptico rápido)

* Desarrollo:

1º. Observar el frotis con el objetivo de inmersión del microscopio

2º. Elegir una zona del frotis en la que las células no estén superpuestas

3º. Contar el número de plaquetas presentes en 10 campos microscópicos

4º. Calcular la cifra media del número de plaquetas

5º. Para cuantificar el número de trombocitos comprendidos en 1mm cúbico de sangre se realiza:

    PLT/mm3= PLT/C.20000

* Interpretación:

Cuando el número de plaquetas es inferior a 130000 hay una trombocitopenia y cuando es superior a 400000 hay una trombocitosis.

Ejercicios:

1.) En condiciones normales, ¿cuántas plaquetas por campo microscópico hay en una zona de un frotis sanguíneo donde los eritrocitos no están superpuestos?

   1 plaqueta por cada 10-20 hematíes.

Recuento de leucocitos

Fecha: 12/01/15

* Fundamento:

El recuento de leucocitos consiste en la determinación del número de leucocitos presentes en un volumen determinado de sangre.

* Material:

- Pipeta diluidora de Thoma para recuento de glóbulos blancos

- Tubo de goma con boquilla

- Cámara de recuento, con retículo tipo Neubauer mejorado

- Cubreobjetos

- Microscopio

* Reactivos:

- Líquido de dilución Turck compuesto de:

 * 2 ml de ácido acético glacial

 *1 ml de solución acuosa de violeta genciana al 1%

 *100 ml agua destilada

El ácido acético produce lisis en los eritrocitos y el violeta de genciana tiñe el núcleo de los leucocitos para que puedan observarse mejor.

* Muestra:

- Sangre capilar obtenida por punción del pulpejo del dedo o sangre venosa anticoagulada con EDTA.

* Desarrollo:

1º. Situar un cubre sobre el retículo de la cámara de recuento.

2º. Aspirar sangre con la pipeta diluidota hasta la señal de 1 y a continuación limpiar cuidadosamente el exterior de la pipeta para aspirar el líquido diluyente hasta la señal de 101

3º. Desenganchar el tubo de goma de la pipeta y homogeneizar el contenido del bulbo sujetando la pipeta por sus dos extremos y agitando suavemente en sentido horizontal durante 2-3 minutos.

4º. Desechar las 3 primeras gotas emitidas por la pipeta.

5º. Depositar la siguiente gota entre la cámara y el cubre.

6º. Dejar reposar unos minutos y enfocar con el objetivo de 10x o 40x del microscopio y contar los leucocitos que hay presentes en 4 cuadrados grandes de las esquinas del retículo.

* Resultado:

Como se cuentan los leucocitos presentes en 4 cuadrados se divide el resultado entre 4 este resultado se multiplica por 10 ya que el espacio entre los cuadrados grandes y el cubre es de 0,1  mm y multiplicarlo por 10 por que la sangre se diluye con el liquido y se llega al enrase de 1 (factor de dilución)

WBC=L/4x 10x D (10)

* Interpretación:

La disminución del WBC se produce en las leucopenias, su aumento produce leucocitosis.

Un WBC normal esta entre 5000 y 11000 leucocitos/ mm3 de sangre.

Ejercicios:

1.) ¿Cuál es el líquido de dilución utilizado en el WBC?

     Turck

2.) ¿Para qué sirve el violeta de genciana?

     Tiñe el núcleo de los leucocitos

3.) ¿Con qué objetivo se pueden contar los leucocitos?

     Si se ve bien con el de 10x

4.) Si la sangre se diluye a 1/10 y se cuentan 100 leucocitos en 2 cuadrados grandes, ¿cuál es el WBC?

    10000 leucocitos/ mm3

Espectofotómetro de hierro

Fecha: 22/01/15

* Fundamento:

Determinar la concentración de hierro sérico (sideremia)

Diagnosticar cualquier tipo de anemia

* Material:

- 4 tubos de hemólisis de vidrio

- Pipeta graduada de 5 ml

- Micropipeta

- Puntas de micropipeta

- Espectrofotómetro

* Reactivos:

- Acetato pH 4,9 + ácido ascórbico (RT)

- Ferrozine (R3)

- IRON CAL (patrón)

* Muestra:

- Suero o plasma heparinizado

* Desarrollo:

1º. Rotular los cuatro tubos de ensayo Blanco RT, Patrón, Blanco Muestra, muestra.

2º. Se echa 1 ml de RT en los 4 tubos, una gota de R3 en B, P y M, 200 uL de agua destilada en B, 200 uL de patrón en P y 200 uL de muestra en BM y M.

3º.Se mezclan e incuban 5 minutos a 37º C.

4º. Se leen las absorbancias en el espectofotómetro y se anotan.

5º. Se calcula el hierro mediante la siguiente formula:

(A) muestra-(A) blanco muestra/ (A) patrón x 100

* Interpretación:

Esta práctica puede determinar y diagnosticar anemia en el paciente.

Determinación del índice de lobularidad (IL)

Fecha: 08/01/15

* Material:

- Microscopio

- Bolígrafo

- Papel

* Reactivos:

- Líquido de inmersión

* Muestra:

- Extensión sanguínea muy fina

* Desarrollo:

1º.Enfocar la extensión sanguínea con el objetivo de inmersión

2º. Observar neutrófilos y contar sus lobulaciones

3º. Clasificar los neutrófilos según Arneth, contando sus lóbulos.

* Resultados:

Se calcula el IL mediante la siguiente formula: IL=NL/NN

NL: número de lóbulos contados

NN: número de neutrófilos observados

* Interpretación:

- La desviación a la izquierda puede representar neutrofilia o neutropenia.

- La desviación a la derecha puede darse en procesos patológicos como las anemias megaloblásticas. Esta alteración también se produce en la agonía.

Ejercicios:

1.) ¿Cuántos tipos de neutrófilos hay según Arneth?

      5 tipos.

2.) ¿Qué tipo de desviación hay si el IL es igual a 2,5?

      Ninguna, los valores normales están entre 1,9-3.

3.) ¿De qué enfermedad es típica la desviación a la izquierda con neutrofilia?

      Apendicitis, sepsis.

Determinación del test de Howell

Fecha: 03/03/15

* Fundamento:

El resultado del test de Howell es el tiempo transcurrido desde la adición del CaCl2 al PRP hasta la coagulación de este.

* Material:

- Rotulador de vidrio

- 2 tubos de hemólisis de vidrio

- Micropipeta

- Puntas de micropipeta

- Baño de agua a 37º C

- Cronómetros

* Reactivos:

- solución salina al 0,85%

- solución de cloruro cálcico.

- Plasma control normal o pool de plasmas normales.

* Muestra:

- Plasma rico en plaquetas preparado correctamente (centrifugar sangre 10 minutos a 1000 revoluciones por segundo.

* Desarrollo:

1º. Atemperar los reactivos y la muestra en el baño a 37º C durante 5 minutos

2º. Rotular un tubo de hemólisis con la letra M (muestra) y otro con la letra C (control)

3º. Introducir los tubos en el baño y depositar 100 microlitros de muestra en M y 100 microlitros de pool en el C

4º. Añadir a los 2 tubos 100 microlitros de solución salina y  a continuación 100 microlitros de CaCl2 y poner en marcha los cronómetros

5º. Coger los tubos por su extremo superior y sin sacarlos del agua, inclinarlos suavemente hacia delante y hacia detrás.

6º. Parar los cronómetros cuando se coagule el contenido de los 2 tubos.

* Resultado:

Normalmente tiene unos valores comprendidos entre 90 y 130 segundos.

Si la muestra es normal el tiempo de coagulación de este debe coincidir aproximadamente con el del control.

* Interpretación:

El resultado del test de Howell es alto en déficits de la vía intrínseca (hemofilia) en afibrinogenemia y hiperfibrinolisis, y en terapias con heparina.

Ejercicios:

1.) ¿Qué tipo de muestra se utiliza?

     PRP

2.) ¿A qué concentración está el CaCl2?

     0,025  M

3.) ¿Cuáles son los valores normales?

     90-130 segundos

4.) ¿Qué tratamiento puede ser controlado con este test?

     Terapias con heparina