martes, 9 de diciembre de 2014

Práctica 13. Tinción panóptico rápido

Práctica 13. Tinción panóptico rápido. 13/11/2014

1.     Material:

-         Cubetas de Wertheim o simliares
-         Cestillo para portas
-         Frasco lavador

2.     Reactivos:

-          Solución nº 1: Solución alcohólica de triarilmetano
-          Solución nº 2: Solución tamponada de xanteno
-          Solución nº 3: Solución tamponada de tiazina
-          Agua destilada

3.     Muestra:
Una extensión sanguínea preparada recientemente y que se ha dejado secar al aire.

4.     Fundamento:
Ésta tinción es un sistema que aúna la policromía y la calidad que proporcionan los métodos clásicos (Giemsa y Wright) con una gran rapidez de ejecución, unos 15 segundos nada más. En esta tinción a diferencia de las anteriores descritas, el colorante no se debe extender sobre el frotis, sino que es un método de inmersión, donde el frotis se sumerge en la solución colorante durante un tiempo determinado. (1 segundo)

5.     Desarrollo:
1º. En tres cubetas de Wertheim o similares se disponen los colorantes solución nº1, nº2 y nº3.
2º. Colocamos la extensión en el cestillo para portas y lo sumergimos en la cubeta con la solución nº1 durante 1 segundo. Repetimos la inmersión cuatro veces (en total 5 segundos). Dejamos escurrir.
3º. Sumergimos a continuación otras cinco veces, cada una con un segundo de duración, en la cubeta con solución nº2. Dejamos escurrir.
4º. Por último, sumergimos otras cinco veces en la cubeta con la solución nº3. Lavamos con agua destilada y dejamos secar.
6.     Resultado:
Echamos una gota de aceite de inmersión sobre la extensión y observamos con el objetivo de 100x en el microscopio. Las coloraciones obtenidas en esta tinción son similares a la de la tinción de Wright y Giemsa, pero podemos variar la intensidad de la tinción modificando el número de inmersiones en los colorantes nº 2 y nº 3, según las tonalidades de rosas o azules que queramos destacar.

7.     Interpretación:
Hemos obtenido una extensión parecida a las dos anteriores. Hemos logrado observar los eritrocitos con un color más intenso que anteriormente. La práctica ha salido bien, ya que la extensión era ideal para tal tinción y poder observarla bien en el microscopio. Unas células rosadas pero con algo más de intensidad.
http://sp9.fotolog.com/photo/57/22/81/capun/1268780005013_f.jpg

Ejercicios:
1.)  ¿En qué se diferencia este método de las otras tinciones clásicas?
Esta tinción es un método de inmersión, la extensión se sumerge en las cubetas, mientras que en las anteriores tinciones, se debía depositar con una pipeta Pasteur el colorante sobre la extensión.
2.)  ¿Cuántos segundos debe sumergirse el frotis en cada una de las soluciones?
Cinco veces, un segundo cada vez en cada cubeta.
3.)  ¿Cuál crees que es la solución fijadora?
Las cubetas con soluciones nº1, nº 2 y nº 3.

Práctica 12. Tinción Wright

Práctica 12. Tinción de wright. 13/11/2014

1.     Material:

-          Microscopio óptico
-          Cristalizador
-          Puentes de tinción
-          Pipetas Pasteur con chupete
-          Frasco lavador
-          Guantes
-          Tubos de ensayo

2.     Reactivos:

-          Solución de eosina-azul de metileno según Wright
-          Solución tampón pH 7’2
-          Aceite de inmersión

3.     Muestra:
Sangre capilar fresca o venosa anticoagulada. Los anticoagulantes más adecuados son la heparina y el EDTA.

4.     Fundamento:
El colorante que utilizamos es una solución de eosina y una mezcla de azul de metileno (50% al 75%) y azur B (10% al 25%) junto con otros derivados del alcohol metílico. Gracias a la presencia del metanol en la composición del colorante, no es necesario la fijación antes de la coloración. Si queremos guardar la extensión sin teñirla más de un día, haremos su fijación para evitar el deterioro del frotis.

5.     Desarrollo:
1º. Realizar un frotis sanguíneo muy fino y se deja secar.
2º. Vertemos 1 ml de eosina-azul de metileno sobre la extensión colocada horizontalmente en el puente de tinción. Lo dejamos actuar un minuto y lo lavamos con la solución tampón pH 7’2. Lo dejamos secar en posición vertical.
3º. Diluimos 0’5 ml de eosina-azul de metileno y 0’5 ml de solución tampón pH 7’2 en un tubo de ensayo. Lo mezclamos bien y cubrimos la extensión con esta dilución. La teñimos durante 3-5 minutos y lo lavamos con agua del grifo. Lo volvemos a lavar con tampón pH 7’2 y lo dejamos secar en posición vertical.

6.     Resultado:
Obtenemos la extensión teñida para observarla en el microscopio con el objetivo 100x. Aplicamos sobre la extensión el aceite de inmersión y nos disponemos a mirar en el microscopio. El resultado de la extensión es la vista de células que están coloreadas con un color rosado, como en la tinción de Giemsa.

https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEj8kA-4vGUvki6lny3B4UWygDtqi-xbEGzMM_aC9vbiPGiuBrr2jqiDUwVryYqyXulNTHV_i5SxtJts-TxTB6tBaVksy8aiKEpLOVuJZyH5MZBIXPXkoswqQCQpXxohKHX-Xyn31gboU48k/s1600/Nueva+imagen+%252819%2529.png

7.     Interpretación:
He podido observar con claridad los eritrocitos de color rosado. La extensión no salió bien, la proporción de sangre no era la ideal, ya que había demasiada. No pude observar, por lo tanto, los leucocitos (ni basófilos, ni monocitos).

Ejercicios:
1.)    ¿Qué tipo de colorante utilizamos en esta tinción?
Una solución de eosina, una mezcla de azul de metileno y azur B
2.)    ¿Qué sustancia empleamos como fijador?
La mezcla de eosina-azul de metileno 0’5 ml y solución tampón pH 7’2 otros 0’5 ml
3.)    ¿Cuánto tiempo debe estar en contacto el frotis con el colorante diluido?

Lo dejamos teñir por unos 3-5 minutos

Práctica 11. Tinción Giemsa

Práctica 11. Tinción de Giemsa 11/11/2014

1.     Material:

-          Microscopio óptico
-          Portas limpios
-          Cristalizador
-          Puentes de tinción
-          Pipetas Pasteur con chupete
-          Frasco lavador
-          Tubos de ensayo

2.     Reactivos:

-          Colorante en solución según Giemsa de Panreac
-          Solución tampón pH 7’2 de Panreac.
-          Metanol
-          Aceite de inmersión

3.     Muestra:
Sangre capilar fresca o venosa anticoagulada.

4.     Fundamento:
Se utiliza como colorante la mezcla de azul de metileno y eosina propuesta por Giemsa. Primero depositaremos el azul de metileno y más tarde la eosiona.

5.     Desarrollo:
1º. Preparamos una extensión sanguínea.
2º. Colocamos la extensión sobre el puente de tinción, en el cristalizador en posición horizontal.
3º. Cubrimos la extensión con metanol durante 3 minutos. Lo dejamos secar al aire y nos disponemos a fijar la extensión.
4º. Diluimos en un tubo de ensayo 0’2 ml de azur-eosina-azul de metileno según Giemsa con 2ml de solución tampón pH 7’2. El colorante no sería válido para otro día, así que la dilución se hace en el momento de la tinción.
5º. Mezclamos la dilución del colorante en el propio tubo, y con una pipeta Pasteur cubrimos la extensión con éste colorante.
6º. Lo lavamos con agua destilada. Más tarde lo lavamos con tampón pH 7’2 hasta eliminar los restos de colorante. Lo secamos en posición vertical.

6.     Resultado:
Cuando obtenemos la tinción seca, le echamos sobre ella una gota de aceite de inmersión y la observamos en el microscopio con el objetivo de 100x. La gota de inmersión debe tocar un poco al objetivo de 100x. Podemos ver los eritrocitos teñidos de color rosa y las plaquetas de color violeta. Los basófilos presentan un núcleo de color púrpura y granulación de color azul oscuro. Los monocitos y linfocitos se observan con un núcleo color violeta y el citoplasma azul, más claro en el monocito.
http://www.microbiologybook.org/bowers/monocyte-darb.jpg

7.     Interpretación:
He obtenido una extensión buena, con sangre capilar de mi propio dedo índice. Después de hacer la tinción y lavarlo con tampón pH 7’2 hasta dejarlo secar, no he logrado ver leucocitos en el microscopio, aunque sí he podido ver con claridad los eritrocitos teñidos de rosa.
http://www.uv.es/~histomed/inmunopatologia/01/peq/eosinofilo-2.jpg

Ejercicios:
1.)    ¿Cuáles son los anticoagulantes más adecuados para esta técnica?
El EDTA o la heparina.
2.)    ¿Con qué reactivo fijamos el frotis?
Con azur-eosina-azul de metileno según Giemsa y con la solución tampón pH 7’2.
3.)    ¿Cuánto tiempo debe actuar el colorante en el frotis?
Debe actuar durante unos 25 minutos.

Práctica 10. Gota gruesa

Práctica 10. Preparación de gota gruesa. 10/11/2014

1)    Material:

-          Un tubo capilar heparinizado o no heparinizado si la sangre es venosa.
-          Una pipeta Pasteur
-          2 portaobjetos
-          2 cubetas de tinción con sus respectivos cestillos

2)    Reactivos:

-          Metanol
-          Agua destilada
-          Una solución del colorante Giemsa al 3% en agua destilada.
Esto sólo sirve las ocho primeras horas transcurridas desde su preparación.

3)    Muestra:
Sangre capilar o venosa anticoagulada con EDTA.

4)    Fundamento:
Para poder estudiar muestras sanguíneas que puedan contener parásitos palúdicos, se hace un estudio con el microscopio de tales muestras haciendo una preparación en forma de extensión fina y otra de gota gruesa en el mismo porta. Para confirmar que hay paludismo debemos fijarnos a los hematíes infectados y a los parásitos que hay dentro de ellos. En estas preparaciones de gota gruesa observamos que los hematíes están lisados.

5)    Desarrollo:
1º. Sujetar por los bordes un portaobjetos limpio.
2º. Situar una pequeña gota de sangre en el centro del portaobjetos.
3º. Colocar sobre el portaobjetos tres gotas de sangre algo más grandes, a un centímetro de distancia de la gota anterior y a la derecha de la misma.
4º. Realizamos con otra portaobjetos una extensión en capa fina con la gota pequeña.
5º. Con una esquina del segundo portaobjetos, unir las tres gotas grandes de sangre con movimientos rápidos y circulares, hasta extenderlas formando una capa gruesa.
6º. Dejamos secar la preparación, con el portaobjetos en posición horizontal y la protegemos de calor excesivo.
7º. Fijamos únicamente la extensión fina, depositando sobre su superficie 3 gotas de metanol y se deja que éste actúe durante unos segundos.
8º. La gota gruesa debe dejarse secar durante 24horas.
9º. Cuando ha transcurrido ese tiempo, vertemos el colorante Giemsa al 3% en una cubeta de coloración.
10º. Colocamos la preparación en el cestillo de la cubeta de coloración que contiene el colorante.
11º. Sumergimos la preparación en la solución Giemsa durante 30-45 minutos. La preparación debe de estar al abrigo de la luz solar.
12º. Vertemos agua destilada en otra cubeta de coloración.
13º. Aclaramos la preparación en la cubeta que contiene agua destilada, durante algunos segundos.
14º. Extraemos la preparación del cestillo.
15º. Dejamos secar la preparación situándola en posición vertical.


6)     Resultados:
Obtenemos una preparación con una extensión fina al lado de una gota gruesa de sangre. Ambas teñidas de un color azulado. Se observa en el microscopio para ver si existe algún parásito palúdico que puede encontrarse de distintas formas; en el interior de la hematíes o fuera de ellos.

7)    Interpretación:
En mi caso, sólo observé mis eritrocitos con mayor intensidad de color, no hubo patología alguna.

http://html.rincondelvago.com/0006893126.jpg

Práctica 9. Realización de una extensión sanguínea

Práctica 9. Realización de una extensión sanguínea. 10/11/2014
1.     Material:

-          Una lanceta automática
-          Algodón o gasas
-          Muestra de sangre capilar o sangre venosa anticoagulada
-          2 portas limpios y sin grasa.
-          Guantes desechables
-          Un rotulador
Para mantener limpios los portas debemos:
-          Lavar los portas con agua y jabón líquido
-          Aclarar los portas con abundante agua caliente
-          Echar alcohol sobre los portas
-          Volver a aclarar los porta con agua destilada y dejarlos secar
-         Coger los portas sólo por los bordes

2.     Reactivos:

-          Un desinfectante: alcohol
-          Solución de etanol-eter etílico

3.     Muestra:

·         Sangre capilar no anticoagulada o sangre venosa adecuadamente anticoagulada.
La sangre capilar se extrae de la siguiente manera:
1º. Coger prefentemente el tercer o cuarto dedo de una de las manos.
2º. Desinfectar la yema del dedo con alcohol sobre una gasa.
3º. Dejar que el desinfectante se evapore.
4º. Con una lanceta, pinchar rápidamente una cara lateral de la yema del dedo.
5º. Retirar la primera gota emitida sobre una gasa o algodón.
6º. Presionar el extremo del dedo hasta obtener la cantidad de sangre deseada.
7º. Tapar el dedo
La sangre venosa tiene que ser extraída hace menos de 3 horas para evitar cambios en las células.
·         Hay que tener siempre en cuenta que la sangre capilar contiene más hematíes y leucocitos, y menos plaquetas que la sangre venosa.
4.     Fundamento:
Las extensiones se realizan depositando una pequeña gota de sangre sobre un portaobjetos, con el otro porta deslizamos la gota de sangre y obtenemos una capa fina de células sanguíneas que puede ser vista adecuadamente en el microscopio.

5.     Desarrollo:
1º. Sujetamos un extremo del porta soporte y lo situamos sobre una mesa.
2º. Depositamos sobre el porta con un capilar cargado de sangre, una pequeña gota de ésta, no menos de 2 cm del extremo opuesto al que agarra la mano.
3º. Colocamos el porta extensor un poco por delante de la gota de sangre formando un ángulo de 45º con el porta soporte.
4º. Desplazar hacia atrás suavemente el porta extensor hasta que alcance la gota de sangre.
5º. Se deja que la gota se extienda a lo largo del extremo del porta extensor que toca el porta soporte.
6º. Antes de que la sangre alcance los bordes del extremo, se desliza el porta extensor hacia delante con un movimiento uniforme y a una velocidad media.
7º. Secamos la extensión para que las células no se distorsionen
8º. Escribimos nuestro nombre en el porta con la extensión.

6.     Resultados:
Obtuve varias extensiones para ensayar. En principio extensiones con muchos defectos. Después de practicar un poco más, conseguí unas extensiones buenas para poder ser vistas sin dificultad en el microscopio. Mis extensiones quedaron así:
https://encrypted-tbn1.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcTCsFhy4E8AGsvUUseAnZkuvYnyMAtNcT3l7alxE05KxP5o0_WV



7.     Interpretación:
Hay que tener en cuenta que en nuestro laboratorio hay muchos portas que están rayados, por lo que obtenemos extensiones incorrectas. Pude apreciar con claridad en el microscopio, los eritrocitos de mi sangre, ya que finalmente conseguí una buena extensión con una proporción ideal de sangre. Una extensión fina y mediana.

Ejercicios:
1.)    ¿Con qué sustancia se anticoagula la sangre venosa cuando se pretende hacer una extensión?
Se anticoagula con EDTA.
2.)    ¿Cuánto tiempo puede pasar, como máximo, desde la extracción de la sangre hasta la realización del frotis?
Como máximo puede pasar 3 horas.
3.)    ¿Qué ángulo debe formar el porta extensor con el porta soporte?

Un ángulo de 45º

Práctica 8. Tinción supravital con azul de metileno

Práctica 8. Tinción supravital con azul de metileno. 7/11/2014

1.     Material:

-          Microscopio óptico
-          Portaobjetos y cubreobjetos
-          Tubos de hemólisis
-          Pipetas Pasteur
-          Laca de uñas
-          Papel parafilm

2.     Reactivos:

-          Azul de metileno
-          Oxalato potásico
-          Agua destilada

3.     Muestra:

Sangre capilar fresca o venosa anticoagulada.

4.     Fundamento:

En esta práctica utilizamos como colorante el azul de metileno. Éste tiñe los núcleos celulares para observar la morfología ácida de la célula ya que el azul de metileno es de carácter básico.

5.     Desarrollo:

1º Preparamos el colorante;
-          Azul de metileno 0.5g
-          Oxalato potásico 1’6g
-          Agua destilada 100ml
2º Depositamos dos gotas de sangre y dos gotas de azul de metileno sobre un portaobjetos y aspiramos la mezcla con una pipeta pasteur y la ponemos en un tubo de hemólisis o se prepara la mezcla directamente en el tubo.
3º Tapamos con parafilm el tubo y dejamos la mezcla en reposo durante 10 minutos.
4º Después de los 10 minutos cogemos con una pipeta pasteur una o dos gotas de la mezcla y la depositamos sobre un portaobjetos.
5º Cubrimos la mezcla con un cubreobjetos.
6º Observamos en el microscopio la preparación resultante con el objetivo de 40x.

6.     Resultado:

Se observa en el microscopio y se hace de manera rápida, ya que las células no permanecen vivas durante mucho tiempo. Se observan los eritrocitos teñidos en comparación con la anterior preparación sin colorante.

7.     Interpretación:

El resultado de la práctica ha salido bien, ya que tenemos un microscopio en buen estado que nos permite ver con facilidad los eritrocitos y otras células si la sangre es fresca. Hemos observado claramente las células teñidas por el colorante azul de metileno, se ve de manera más clara con éste.


Ejercicios:

1.)    ¿En qué se diferencia una tinción vital de una supravital?
Las tinciones vitales se efectúan sobre células que están vivas, mediante la introducción de un colorante en la circulación de un organismo vivo.
2.)    ¿Cuáles son los colorantes vitales más utilizados?
El azul de metileno y verde Jano
3.)    ¿Qué tipo de estructuras tiñe selectivamente el verde Jano?
Las mitocondrias de verde brillante y las paredes celulares de verde
4.)    ¿Cuáles son las ventajas de una tinción supravital?
Porque es una técnica útil para investigar las células de morfología dudosa en las extensiones teñidas. Es de gran utilidad para identificar monocitos.
5.)    ¿Cuáles son los inconvenientes?

Que las células no se mantienen vivas, acaban desapareciendo por la tinción al ser solubles en alcohol.