Espectofotómetro de hemoglobina.

Fecha: 19/01/2015

* Fundamento:

La Hb es una proteína que contiene hierro. Cuando el nivel de hemoglobina aparece por debajo de los niveles normales, indica anemia que puede obedecer a diferentes causas: anemia primaria, cáncer, embarazo, enfermedades renales o hemorragias.

Si es alto, puede deberse a cardiopatías, deshidratación o estancia en lugares de gran altitud.

* Material:

- Espectofotómetro

- Cubetas de 1,0 cm de paso de luz.

- Equipamiento habitual de laboratorio.

* Reactivos:

- Cianuro de potasio

- Ferricianuro de potasio

- Dihidrógeno fosfato de potasio

- Hemoglobin CAL

* Muestra:

- Sangre capilar o venosa

* Desarrollo:

1º. Condiciones de ensayo:

- Longitud de onda: 540 nm

- Cubeta: 1 cm paso de luz

- Temperatura: 15-25ºC

2º. Ajustar el espectrofotómetro a cero frente al agua destilada.

3º. Pipetear:
A) Método MACRO

	Blanco	Patrón	Muestra
RT (mL)	5.0	5.0	5.0
Calibrador (microlitros)	--	20	--
Muestra (microlitros)	--	--	20

B) Método MICRO

	Blanco	Patrón	Muestra
RT (mL)	2.5	2.5	2.5
Calibrador (microlitros)	--	10	--
Muestra (microlitros)	--	--	10

4º. Mezclar e incubar 3 minutos a temperatura ambiente (15-25ºC)

5º. Leer la absorbancia (A) del calibrador y la muestra, frente al Blanco de reactivo.

6º Hacemos los cálculos con los resultados obtenidos:

(A) Muestra / (A) Patrón x 15 = g/dL de hb

* Resultado:

Hemos obtenido un resultado de hemoglobina que oscila en los niveles normales de ésta.

* Interpretación:

La práctica ha salido como lo esperado, como resultado nos ha dado 14g/dL, algo que está dentro de los parámetros normales en mujeres y hombres.

Estudio de la fragilidad osmótica de los hematíes.

Fecha: 27/02/2015

* Fundamento:

El estudio de esta fragilidad, valora la resistencia de los eritrocitos a soluciones de presión osmótica decreciente, en condiciones constantes de pH y de temperatura. Se enfrentan para ello, los hematíes problema a soluciones tamponadas de cloruro sódico cuya concentración es decreciente a partir de 9 gramos por mil. (solución hipotónica).

Cuando los eritrocitos están en contacto con soluciones hipotónicas, penetra agua a través de su membrana y se hinchan. Al hincharse, una parte de la hemoglobina que contienen puede salir al exterior a través de los poros de su membrana. Si la entrada de líquido es excesiva, los hematíes se rompen y dejan libre toda la Hb que engloban.

En condiciones normales, un eritrocito puede aceptar sin hemolizarse una entrada de agua que incremente un volumen en un 70% como máximo.

Esta prueba evalúa la capacidad que tienen los eritrocitos de soportar un incremento de su contenido acuoso.

* Material:

- Pipetas Pasteur

- Tubos de centrífuga iguales entre sí.

- Un reloj.

- Una centrífuga.

- Un espectofotómetro.

- Cubetas de espectofotómetro.

-  Una gradilla.

* Reactivos:

- Suero fisiológico

- Agua destilada

* Muestra:

- Sangre venosa anticoagulada.

* Procedimiento:

1º. Preparar una batería de soluciones de cloruro sódico, a concentraciones diferentes, como a continuación:

Tubo nº	1	2	3	4	15	16	17	18
Agua destilada (gotas)	0	1	2	3	14	15	16	17
Suero fisiológico tamponado (gotas)	18	17	16	15	4	3	2	1
Concentración obtenida en (g/l)	9	8.5	8	7.5	2	1.5	1	0.5

2º. Añadir a cada tubo 1 gota (50 microlitros) de sangre completa.

3º. Agitar suavemente los tubos.

4º. Dejar los tubos en reposo, al menos 30 minutos, a temperatura ambiente. (25 ºC).

5º. Centrifugar los tubos a 2000 rpm, durante 5 minutos.

* Resultado:

Se recoge de forma separada el líquido contenido en todos los tubos, y se mide la absorbancia (A) de cada uno de ellos, en un espectofotómetro ajustado a una longitud de onda de 540 nm.

Los resultados espectofotómetricos de cada tubo se ofrecen en forma de porcentaje (%) de hemólisis. Se considera que la A medida en el líquido procedente de tubo nº 18 corresponde a un 100% de hemólisis. El porcentaje de hemólisis se calcula con la siguiente fórmula:

% de hemólisis = A/Am x 100

Am = Absorbancia del líquido contenido en el tubo nº 18.

* Interpretación

Cuando la ROE baja, aumenta la hemólisis en los tubos que contienen solución salina a mayor concentración. Esto sucede en la esferocitosis hereditaria, en estomacitosis hereditaria, ovalocitosis, debido a que en estas enfermedades la superficie de los hematíes está disminuida con respecto a su volumen.

Cuando la ROE sube, la aparición de la hemólisis se retarda y empieza a nivel de tubos que contienen solución salina a una concentracíon menor que lo previsto. Esto sucede con anemias ferropénicas.

Ejercicios:

1.) ¿Qué concentración de NaCl tiene el suero fisiológico?

9 gramos

2.) ¿En qué porcentaje se puede incrementar normalmente el volumen de los hematíes sin que estos se rompan?

Un 70% como máximo

3.) ¿Qué sustancia se emplea para anticoagular la sangre en esta prueba?

La heparina

4.) En esta prueba, ¿cuál es la concentración salina menor a la que se preparan las soluciones?

A una concentración de 0'5 g/l

5.) En condiciones normales, ¿a qué concentración salina suele producirse una hemólisis del 50%?

A 4 o 4'5 g/l

6.) ¿En qué enfermedades se produce una disminución de la ROE?

En la esferocitosis hereditaria, en la eliptocitosis u ovalocitosis congénita y en la estomatocitosis hereditaria.

Pruebas de la sacarosa

Fecha: 29/02/2015

* Fundamento:

Esta prueba consiste en situar los hematíes problema en medio de baja fuerza iónica. En este medio, los eritrocitos tienden a fijar el complemento, por lo que cuando los eritrocitos presentes en la muestra tienen una sensibilidad anormalmente alta al complemento, tienden a sufrir la acción de este y se lisa.

* Material:

- Pipetas Pasteur

- Pipetas graduadas (1 de 5 ml, 2 de 2 ml y 3 de 0'5 ml)

- Una pipeta automática capaz de dispensar 0'1 ml (100 microlitros)

- Puntas de pipeta automática para dispensar 0'1 ml.

- 6 tubos de centrífuga

- Un reloj

- Una centrífuga

- Un espectofotómetro

- Cubetas de espectofotómetro.

- Un rotulador de vidrio.

- Una gradilla

* Reactivos:

- Solución acuosa de sacarosa a una concentración del 9'24%.

- Sangre control.

- Solución acuosa de amoniaco a una concentración de 0'04%

- Suero fisiológico.

* Muestra:

- Sangre venosa anticoagulada

* Procedimiento:

1º. Rotular 3 tubos. Uno con las siglas SF (suero fisiológico) otro con las siglas SC (sangre control) y otro con las siglas SP (sangre problema).

2º. Rellenar estos tubos según las indicaciones del cuadro siguiente:

	Tubo SF	Tubo Sc	Tubo SP
Suero fisiológico (en ml)	1.8
Solución de sacarosa (en ml)		1.8	1.8
Sangre control (en ml)		0.2
Sangre problema (en ml)	0.2		0.2

3º. Agitar suavemente los tubos.

4º. Dejar los tubos en reposo a temperatura ambiente y durante 30 minutos.

5º. Centrifugar los tubos a 2000 rpm durante 5 minutos.

* Resultados:

Se requiere la preparación de 3 tubos: tubo blanco (TB), tubo patrón (TPa) y tubo problema (TPr). Se explica con esta tabla:

	TB	TPr	TPa
Solución de amoniaco En (ml)	5	5	5
Suero fisiológico (en ml)	0.3
Sobrenadante del tubo SP (en ml)		0.3
Sobrenadante del tubo SF (en ml)			0.3

Tras preparar estos tubos, se recoge el líquido contenido en cada uno de ellos y se mide su absorbancia en un espectofotómetro.

En esta lectura espectofotométrica, se utiliza el líquido del tubo blanco para poner el aparato a 0 de A, y el líquido del tubo patrón se emplea para determinar la A que corresponde a un 100% de hemólisis.

Los resultados se hacen en tanto por ciento de hemólisis con la siguiente fórmula:

% de hemólisis = A/Am x 100

Am= Absorbancia del líquido contenido en el tubo patrón.

* Interpretación:

Esta prueba suele ser positiva en la HPM. El grado de positividad que se produce en esta enfermedad oscila entre un 10 y un 85 % de hemólisis.

Esta prueba en cambio, es siempre negativa en la diseritropoyesis congénita de tipo II.

Ejercicios:

1.) ¿Con qué solución se hemolizan los hematíes vertidos en el tubo problema?

Con la solución de amoniaco

2.) ¿A qué concentración se prepara la solución de la sacarosa?

A una concentración del 9'24%

3.) ¿Cómo se llama también la sacarosa?

Azúcar común

4.) ¿Qué es el ACD?

Ácido cítrico-dextrosa.

5.) ¿Cómo se prepara el tubo blanco?

Con 5 ml de solución de amoniaco y 0'3 ml de suero fisiológico.

6.) ¿Qué porcentaje de hemólisis suele producirse, con la prueba de la sacarosa, en la sangre de la HPN?

Entre un 10 y un 85%

Detección de crioglobulinas.

Fecha: 12/01/2015

* Fundamento:

Se basa esta detección en la exposición del suero problema a la acción de una temperatura baja. Si este suero contiene crioglobulinas, estas precipitan con el frío, y el precipitado formado adopta el aspecto de partículas blanquecinas.

* Material:

- Pipeta Pasteur

- Tubo de ensayo

- Una gradilla

- Una nevera.

- Un baño de agua.

- Un capilar de microhematocrito.

- Plastilina.

- Centrífuga de microhematocrito.

- Una regla o un lector de microhematocrito.

* Reactivos:

No se usan en esta práctica.

* Muestra:

Suero transparente, obtenido de sangre coagulada completamente a temperatura corporal.

* Procedimiento:

1º. Depositar el suero problema en un tubo de ensayo.

2º. colocar el tubo que contiene el suero problema en una nevera, de forma que esté a una temperatura comprendida entre los 4 y los 6ºC.

3º. Examinar el tubo a los 30 minutos y después cada día, durante 6 días.

* Resultados:

Han aparecido unas partículas blanquecinas, y son incubadas a 37ºC. No han desaparecido, por lo que se considera que son restos de fibrina.

* Interpretación:

No hemos podido realizar esta práctica correctamente, ya que no hemos obtenido tales partículas blanquecinas que sean las reales crioglobulinas.

* Ejercicios:

1.) ¿A qué temperatura se debe someter el suero en una detección de crioglobulinas?

 El suero se debe someter a una temperatura de entre 4 a 6ºC.

2.) Si el precipitado no se reabsorbe con calor, ¿de qué sustancia está formado? 

Si el precipitado no se reabsorbe con el calor se trata de restos de fibrina.
3.) ¿Cuántas cruces se le asigna a un suero que adquiere un aspecto lechoso? 

Se le asigna 3 cruces

4.) ¿A qué concentración sérica suelen encontrarse las crioglobulinas tipo I? 

Suelen encuentrarse en una concetración >5mg/ml

5.¿Qué manifestaciones clínicas puede producir una crioglobulemia? 

Las manifestaciones clínicas son: aumento viscosidad sangre, precipitación de crioglobulinas y depósito de inmunocomplejos.

Concentrado de leucocitos

Fecha: 8/01/2015

* Fundamento: 

Una obtención de la capa leucoplaquetaria para una obersvación de anomalías en los leucocitos.

* Material:

- Un tubo de centrífuga

- Una centrífuga

- Una pipeta Pasteur fina.

- 2 portaobjetos

* Reactivos:

- Los necesarios para efectuar la tinción hematológica seleccionada.

* Muestra:

- Sangre venosa anticoagulada con citrato sódico.

* Desarrollo:

1º. Mezclar la sangre y el anticoagulante.

2.º Centrifugar la sangre a 1500 rpm y durante 15 minutos.

3º. Retirar el sobrenadante obtenido (plasma)

4º. Recoger de 0'2 a 0'3 ml de capa leocuplaquetaria.

5º. Extender varias gotas de la capa leucoplaquetaria, sobre un portaobjetos, a modo de frotis.

6º. Teñir este frotis mediante tinción de panóptico rápido.

* Resultados:

Nos ha permitido el estudio de numerosos leucocitos de todos los tipos. Además, facilita la visualización de múltiples plaquetas.

* Interpretación:

No hemos podido observar ninguna alteración, ni anomalía en los leucocitos.

* Ejercicios:

1.) ¿Cómo se llama a la condensación del material genético inactivado de un cromosoma X? 

Corpúsculo de Barr
2.) ¿Qué otro nombre recibe la capa leucoplaquetaria? 

Buffy coat
3.) Tras centrifugar la sangre, ¿en qué capa se sitúan los hematíes? 

Se sitúan en la capa eritrocitaria.

Electroforesis de hemoglobinas.

Fecha: 29/01/2015

* Fundamento:

Separar las moléculas de la hemoglobina mediante la electroforesis.
En la sangre hay varios tipos de hemoglobinas y cada una de ellas adquiere una carga eléctrica neta negativa, las Hb se van desplazando progresivamente hacia el ánodo.

*Material:

- Una gradilla
- Tubos de centrífuga
- Pipetas Pasteur
- Pipetas graduadas de 0'5, 1, 2 y 5 ml
- Una centrífuga
- Un espectofotómetro
- Cubetas de espectofotómetro
- Un vidrio de reloj
- Bateas
- Pinzas
- Papel de filtro
- Probetas de 100 ml de capacidad
- Una placa de vidrio de unos 18 x 18 cm
- Una estufa
- Un reloj
- Una fuente de alimentación
- Una cubeta: recipiente donde se lleva a cabo la electroforesis
- Un puente: en él se sitúan las tiras de soporte para que estén horizontales.
- Un aplicador: se utiliza para depositar la muestra sobre las tiras de soporte.
- Medio de soporte: es el medio físico en el cual migran las proteínas.
- Un fotodensímetro

*Reactivos:

- Suero fisiológico (solución cloruro sódico al 0'9%)

- Agua destilada

- Cloroformo o triclorometano

- Tampón: es el líquido que ioniza las proteínas

Se utiliza un tampón TRIS-GLICOCOLA, su composición es la siguiente: 

Tris-Hidroximetilaminometano -> 7'05 g.

Glicocola -> 11' 3 g.

Agua destilada -> c.s.p. 1000 ml

- Colorante: se emplea para poner de manifiesto las bandas que se han formado tras la migración electroforética.

Su composición recomendada es la siguiente:

Rojo Ponceau -> 0'5 g.

Ácido tricloroacético al 5% -> 100 ml
- Decolorante: elimina el exceso de colorante que tiñe las tiras.
Utilizamos el rojo Ponceau.
- Deshidratante: alcohol metílico (metanol)
- Solución transparentadora.

* Muestra:

Hemolizado (preparado de sangre anticoagulada)

* Desarrollo:

1º. Anticoagular la sangre problema
2º. Centrifugar la sangre anticoagulada a 3500 rpm, durante 15 minutos.
3º. Retirar el plasma.
4º. Resuspender los hematíes con 4-5 ml de suero fisiológico.
5º. Centrifugar la suspensión de hematíes a 3500 rpm durante 15 minutos.
6º. Retirar el sobrenadante.
7º. Repetir el lavado de hematíes 3 veces más hasta obtener un concentrado de hematíes lavados.
8º. Hemolizar los hematíes, añadiendo, a 1 volumen de estos, 1'5 volúmenes de agua destilada y 0'5 volúmenes de cloroformo.
9º. Agitar fuertemente la mezcla anterior.
10º. Centrifugar la mezcla a 3500 rpm, durante 30 minutos.
11º. Retirar el sobrenadante.
12º. Determinar la concentración de Hb que está presente en el hemolizado.
13º. Diluir el hemolizado con agua destilada hasta lograr que tenga una concentración de Hb de 5g7100 ml.

* Resultado:

La observación visual de las tiras transparentadas permite detectar la presencia de bandas anómalas, o de alteraciones en las bandas normales. 

* Interpretación:

Se ha podido observar con claridad la distinción de una banda a otra.

* Ejercicios:

1.) ¿De qué material son las tiras empleadas en esta técnica?

 Las tiras empleadas son de Acetato de celulosa.

2.) ¿Cuál es el decolorante del rojo Ponceau? 

El decolorante es la solución acuosa de ácido acética al 5%.  

3.¿Cómo se llama el aparato que lee las bandas de las tiras y las transforma en curvas de área mensurable? 

Se llama fotodensitómetro.

4.) ¿En qué enfermedad aparece una banda electroforética de HB?

 Aparece en la anemia falciforme
5.) ¿Cuál es la Hb normal más electronegativa? 

La Hb normal más electronegativa  es la Hb A

Recuento de plaquetas con Hemocitómetro

Fecha: 12/01/2015

* Fundamento:

Calcular con la cámara de recuento, el número de plaquetas que se encuentra en sangre por cada mm3.

* Material:

- Un tubo de ensayo

- Una pipeta de Thoma, para recuento de eritrocitos.

- Un tubo de goma con boquilla.

- Gasas.

- Una cámara de recuento, con un retículo tipo Neubauer mejorado.

- Un cubreobjetos.

- Un microscopio.

- Una placa de Petri.

- Papel de filtro.

* Reactivos:

- Agua destilada.

- Líquido de dilución.

* Muestra: 

- Sangre capilar o sangre venosa.

* Desarrollo:

1º. Verter en un tubo de ensayo, el volumen necesario de líquido de dilución para efectuar los ensayos requeridos.

2º. Con una pipeta diluidora de tipo Thoma, aspirar la muestra de sangre hasta la señal 1.

3º. Limpiar con una gasa, la sangre adherida al exterior de la pipeta.

4º. Aspirar el líquido de dilución hasta la señal de 101 de la pipeta.

5º. Agitar la pipeta, durante 5 minutos.

6º. Desechar las 5 primeras gotas de dilución que salen de la pipeta.

7º. Cargar una cámara de recuento, con la dilución de sangre que queda en la pipeta.

8º. Colocar la cámara de recuento cargada, en el interior de una cámara húmeda.

9º. Dejar reposar la cámara de recuento durante 15 minutos.

10º. Colocar la cámara de recuento sobre la platina del microscopio.

11º. Enfocar uno de los retículos de la cámara de recuento, con un objetivo de bajo aumento.

12º. Enfocar uno de los cuadrados grandes del retículo, con el objetivo de mediano aumento.

13º. Contar la totalidad de las plaquetas depositadas en ese cuadrado grande.

* Resultado:

 La cifra de plaquetas nos ha salido reducida.

* Interpretación:

Esta reducción de la cifra, puede deberse a una trombocitopenia o una trombopenia.

* Ejercicios:

1.¿Qué tipo de pipeta diluidora se utiliza en el recuento de plaquetas? 

Con la pipeta de Thoma diluidora para glóbulos rojos
2.¿Qué funciones desempeña el líquido de dilución empleado?  

El líquido rompe los hematíes, evita la agregación de las plaquetas entre sí y su adhesión a otros elementos y facilita la visualización de las plaquetas al hacerlas refringéntes.
3.¿Cuánto líquido de dilución se necesita para efectuar un ensayo? 

Se necesita un 1ml de líquido aproximadamente.

4.¿Con qué se puede preparar una cámara húmeda? 

Se puede preparar con una placa de petri y colocamos dentro un papel de filtro embebido de agua destilada.

5.¿Con qué objetivo se cuentan las plaquetas? 

Para determinar si puede haber una enfermedad.

6.¿Cómo se aprecian los trombocitos en este recuento? 

Se aprecian como corpúsculos redondeados u ovalados de tamaño pequeño y muy refringentes.