* Fundamento:
El estudio de esta fragilidad, valora la resistencia de los eritrocitos a soluciones de presión osmótica decreciente, en condiciones constantes de pH y de temperatura. Se enfrentan para ello, los hematíes problema a soluciones tamponadas de cloruro sódico cuya concentración es decreciente a partir de 9 gramos por mil. (solución hipotónica).
Cuando los eritrocitos están en contacto con soluciones hipotónicas, penetra agua a través de su membrana y se hinchan. Al hincharse, una parte de la hemoglobina que contienen puede salir al exterior a través de los poros de su membrana. Si la entrada de líquido es excesiva, los hematíes se rompen y dejan libre toda la Hb que engloban.
En condiciones normales, un eritrocito puede aceptar sin hemolizarse una entrada de agua que incremente un volumen en un 70% como máximo.
Esta prueba evalúa la capacidad que tienen los eritrocitos de soportar un incremento de su contenido acuoso.
* Material:
- Pipetas Pasteur
- Tubos de centrífuga iguales entre sí.
- Un reloj.
- Una centrífuga.
- Un espectofotómetro.
- Cubetas de espectofotómetro.
- Una gradilla.
* Reactivos:
- Suero fisiológico
- Agua destilada
* Muestra:
- Sangre venosa anticoagulada.
* Procedimiento:
1º. Preparar una batería de soluciones de cloruro sódico, a concentraciones diferentes, como a continuación:
Tubo nº
|
1
|
2
|
3
|
4
|
15
|
16
|
17
|
18
|
Agua destilada
(gotas)
|
0
|
1
|
2
|
3
|
14
|
15
|
16
|
17
|
Suero fisiológico
tamponado
(gotas)
|
18
|
17
|
16
|
15
|
4
|
3
|
2
|
1
|
Concentración
obtenida en
(g/l)
|
9
|
8.5
|
8
|
7.5
|
2
|
1.5
|
1
|
0.5
|
2º. Añadir a cada tubo 1 gota (50 microlitros) de sangre completa.
3º. Agitar suavemente los tubos.
4º. Dejar los tubos en reposo, al menos 30 minutos, a temperatura ambiente. (25 ºC).
5º. Centrifugar los tubos a 2000 rpm, durante 5 minutos.
* Resultado:
Se recoge de forma separada el líquido contenido en todos los tubos, y se mide la absorbancia (A) de cada uno de ellos, en un espectofotómetro ajustado a una longitud de onda de 540 nm.
Los resultados espectofotómetricos de cada tubo se ofrecen en forma de porcentaje (%) de hemólisis. Se considera que la A medida en el líquido procedente de tubo nº 18 corresponde a un 100% de hemólisis. El porcentaje de hemólisis se calcula con la siguiente fórmula:
% de hemólisis = A/Am x 100
Am = Absorbancia del líquido contenido en el tubo nº 18.
* Interpretación
Cuando la ROE baja, aumenta la hemólisis en los tubos que contienen solución salina a mayor concentración. Esto sucede en la esferocitosis hereditaria, en estomacitosis hereditaria, ovalocitosis, debido a que en estas enfermedades la superficie de los hematíes está disminuida con respecto a su volumen.
Cuando la ROE sube, la aparición de la hemólisis se retarda y empieza a nivel de tubos que contienen solución salina a una concentracíon menor que lo previsto. Esto sucede con anemias ferropénicas.
Ejercicios:
1.) ¿Qué concentración de NaCl tiene el suero fisiológico?
9 gramos
2.) ¿En qué porcentaje se puede incrementar normalmente el volumen de los hematíes sin que estos se rompan?
Un 70% como máximo
3.) ¿Qué sustancia se emplea para anticoagular la sangre en esta prueba?
La heparina
4.) En esta prueba, ¿cuál es la concentración salina menor a la que se preparan las soluciones?
A una concentración de 0'5 g/l
5.) En condiciones normales, ¿a qué concentración salina suele producirse una hemólisis del 50%?
A 4 o 4'5 g/l
6.) ¿En qué enfermedades se produce una disminución de la ROE?
En la esferocitosis hereditaria, en la eliptocitosis u ovalocitosis congénita y en la estomatocitosis hereditaria.
Hola,
ResponderEliminarHe estado provando la práctica en el laboratorio con mis alumnos, y a partir del tubo 9-10 vemos que las absorvacias pasan de 1 i se estabilizan. Es normal?
Gracias