Electroforesis de hemoglobinas.

Fecha: 29/01/2015

* Fundamento:

Separar las moléculas de la hemoglobina mediante la electroforesis.
En la sangre hay varios tipos de hemoglobinas y cada una de ellas adquiere una carga eléctrica neta negativa, las Hb se van desplazando progresivamente hacia el ánodo.

*Material:

- Una gradilla
- Tubos de centrífuga
- Pipetas Pasteur
- Pipetas graduadas de 0'5, 1, 2 y 5 ml
- Una centrífuga
- Un espectofotómetro
- Cubetas de espectofotómetro
- Un vidrio de reloj
- Bateas
- Pinzas
- Papel de filtro
- Probetas de 100 ml de capacidad
- Una placa de vidrio de unos 18 x 18 cm
- Una estufa
- Un reloj
- Una fuente de alimentación
- Una cubeta: recipiente donde se lleva a cabo la electroforesis
- Un puente: en él se sitúan las tiras de soporte para que estén horizontales.
- Un aplicador: se utiliza para depositar la muestra sobre las tiras de soporte.
- Medio de soporte: es el medio físico en el cual migran las proteínas.
- Un fotodensímetro

*Reactivos:

- Suero fisiológico (solución cloruro sódico al 0'9%)

- Agua destilada

- Cloroformo o triclorometano

- Tampón: es el líquido que ioniza las proteínas

Se utiliza un tampón TRIS-GLICOCOLA, su composición es la siguiente: 

Tris-Hidroximetilaminometano -> 7'05 g.

Glicocola -> 11' 3 g.

Agua destilada -> c.s.p. 1000 ml

- Colorante: se emplea para poner de manifiesto las bandas que se han formado tras la migración electroforética.

Su composición recomendada es la siguiente:

Rojo Ponceau -> 0'5 g.

Ácido tricloroacético al 5% -> 100 ml
- Decolorante: elimina el exceso de colorante que tiñe las tiras.
Utilizamos el rojo Ponceau.
- Deshidratante: alcohol metílico (metanol)
- Solución transparentadora.

* Muestra:

Hemolizado (preparado de sangre anticoagulada)

* Desarrollo:

1º. Anticoagular la sangre problema
2º. Centrifugar la sangre anticoagulada a 3500 rpm, durante 15 minutos.
3º. Retirar el plasma.
4º. Resuspender los hematíes con 4-5 ml de suero fisiológico.
5º. Centrifugar la suspensión de hematíes a 3500 rpm durante 15 minutos.
6º. Retirar el sobrenadante.
7º. Repetir el lavado de hematíes 3 veces más hasta obtener un concentrado de hematíes lavados.
8º. Hemolizar los hematíes, añadiendo, a 1 volumen de estos, 1'5 volúmenes de agua destilada y 0'5 volúmenes de cloroformo.
9º. Agitar fuertemente la mezcla anterior.
10º. Centrifugar la mezcla a 3500 rpm, durante 30 minutos.
11º. Retirar el sobrenadante.
12º. Determinar la concentración de Hb que está presente en el hemolizado.
13º. Diluir el hemolizado con agua destilada hasta lograr que tenga una concentración de Hb de 5g7100 ml.

* Resultado:

La observación visual de las tiras transparentadas permite detectar la presencia de bandas anómalas, o de alteraciones en las bandas normales. 

* Interpretación:

Se ha podido observar con claridad la distinción de una banda a otra.

* Ejercicios:

1.) ¿De qué material son las tiras empleadas en esta técnica?

 Las tiras empleadas son de Acetato de celulosa.

2.) ¿Cuál es el decolorante del rojo Ponceau? 

El decolorante es la solución acuosa de ácido acética al 5%.  

3.¿Cómo se llama el aparato que lee las bandas de las tiras y las transforma en curvas de área mensurable? 

Se llama fotodensitómetro.

4.) ¿En qué enfermedad aparece una banda electroforética de HB?

 Aparece en la anemia falciforme
5.) ¿Cuál es la Hb normal más electronegativa? 

La Hb normal más electronegativa  es la Hb A