Práctica 18. Cuerpos de Heinz

Práctica 18. Detección de cuerpos de Heinz. 28/11/2014

1.     Material:

-         Un tubo de ensayo

-         2 pipetas graduadas

-         Una pipeta Pasteur

-         Un baño de agua

-         2 portaobjetos

-         Un  microscopio

2.     Reactivos:

·        Colorante. Éste consiste en una solución de cristal violeta que puede prepararse de la siguiente forma:

1º. Mezclar 20 g de cristal violeta con 80 cc de suero fisiológico y 20 cc de agua destilada.

2º. Agitar la mezcla, durante 5 minutos, para asegurar la disolución de sus componentes.

3º. Filtrar la disolución

4º. Añadir al líquido filtrado 82 cc de suero fisiológico y 18 cc de agua destilada.

5º. Conservar la solución colorante a temperatura ambiente, durante un tiempo indefinido.

·         Líquido de inmersión.

3.     Muestra:

Sangre total.

4.     Desarrollo:

1º. Mezclar en un tubo de ensayo, volúmenes iguales de la solución de cristal violeta y de la sangre problema.

2º. Incubar la mezcla a 37ºC, durante 5 minutos

3º. Hacer una extensión fina de la mezcla.

4º Dejar secar la extensión.

5º. Observar la extensión con el microscopio, utilizando para ello el objetivo de inmersión.

5.     Fundamento:

Los precipitados intraeritrocitarios de Hb desnaturalizada se tiñen con el cristal violeta y adquieren al aspecto de pequeñas granulaciones que reciben el nombre de cuerpos de Heinz.

6.     Resultados:

Los cuerpos de Heinz, una vez teñidos, se observan como pequeñas granulaciones de color púrpura que se localizan en la periferia de los hematíes.

7.     Interpretación:

La presencia de cuerpos Heinz en el interior de los eritrocitos, y por lo tanto, el hallazgo de precipitados de Hb, se encuentra en una serie de defectos congénitos de ésta, que conllevan una alteración en el enlace de la hemoglobina.

También aparecen cuerpos Heinz intraeritrocitarios en el déficit congénito de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, por precipitación de la Hb oxidada.

Ejercicios:

1.)    ¿Cuál es el colorante usado para teñir los cuerpos de Heinz?

Una solución de cristal violeta

2.)    ¿De qué color son los cuerpos de Heinz teñidos?

Son de color púrpura.

3.)    ¿Dónde se localizan los cuerpos de Heinz?

En la periferia de los hematíes.

Práctica 17. Contaje de reticulocitos

Práctica 17. Contaje de reticulocitos. 27/11/2014

1.     Material:

-         Microscopio óptico

-         Tubos de hemólisis

-         Pipetas Pasteur

-         Portaobjetos

-         Baño de agua

-         Sistema de filtración

2.     Reactivos:

-         Azul de cresil brillante en polvo

-         Solución salina al 0’9%

-         Citrato sódico al 3%

-         Agua destilada

-         Aceite de inmersión

3.     Muestra:

Sangre anticoagulada con EDTA. Debido a que los reticulocitos también maduran in vitro, es aconsejable que la sangre utilizada se haya extraído recientemente, como máximo 6 horas antes de su análisis.

4.     Desarrollo:

1º. Preparación del colorante

·         Mezclamos 80 ml de solución salina y 20 ml de citrato sódico al 3%

·         Pesamos 1 g de azul de cresil brillante y lo disolvemos en la mezcla anterior.

·         Filtramos antes de usarlo.

2º. Tinción de los reticulocitos:

Es una tinción supravital, es decir, se hace mientras las células aún están vivas.

Para ello, echamos 3 gotas de la solución colorante en un tubo de hemólisis y otras 3 gotas de sangre total previamente homogenizada.

Mezclamos suavemente y tapamos con papel parafilm. Introducimos en el baño de agua a 37º durante 5 minutos.

Pasado este tiempo volvemos a homogenizar y tomamos una gota de la suspensión para depositarla en un porta.

Realizamos una extensión y dejamos secar al aire.

5.     Fundamento:

Podemos observar los reticulocitos al microscopio óptico mediante la tinción con colorantes vitales. Estos colorantes dan lugar a la precipitación de los restos de ARN, y se observan como filamentos de color azul intenso en el interior de la célula.

Según el grado de maduración que posea el reticulocito presentará un modelo de retículo distinto, de ovillo en el caso de los más inmaduros o de gránulos escasos para los más maduros.

6.     Resultados:

Con una gota de aceite de inmersión observamos la extensión con el objetivo de 100x. Los hematíes se habrán teñido de color verde amarillento y los reticulocitos se diferencian porque presentan en su interior unos hilos finos de color azul.

Se deben contar 2000 hematíes en total, y el cálculo del porcentaje de reticulocitos es el siguiente:

% reticulocitos = Nº de reticulocitos contados/ Nº de hematíes contados X100

Para descartar errores en la técnica, debemos realizar dos extensiones y hacer el recuento en ambas, de manera que la diferencia entre ellas sea igual o menor a 5 reticulocitos.

El resultado final es la media de los dos porcentajes obtenidos.

7.     Interpretación:

En adultos y niños los valores normales están entre 0’5 y 1’5%.

La cantidad de reticulocitos expresada en tanto por ciento es un valor relativo referido a una cifra normal de hematíes. Por ello, cuando existe una anemia con disminución en la cantidad de hematíes se compensa con un aumento en el número de reticulocitos y debemos corregir su valor en tanto por ciento para poder considerarlo real.

La práctica la hicimos con una muestra de mi sangre. No salió como lo esperado, ya que el tubo que obtenía mi sangre no estuvo el suficiente tiempo en baño de agua, y tampoco llegaba a los 37º.

Ejercicios:

1.)    ¿Qué son los reticulocitos?

Son eritrocitos inmaduros que contienen un retículo o red cromatínica formada por restos de ARN.

2.)    ¿Qué tipo de tinción estamos utilizando?

Es una tinción supravital que se hace mientras las células están vivas.

3.)    ¿Por qué hacemos la corrección del porcentaje de reticulocitos?

Para saber si existe una anemia muy intensa, y para evitar pensar que hay una capacidad regenerativa medular intensa, se debe hacer una segunda corrección.

4.)    ¿Qué nos expresa el IPR?

Nos da un valor numérico de la estimulación hematopoyética por encima de la actividad de la línea base normal.

Práctica 16. Hematocrito

Práctica 16. Valor de hematocrito. 20/11/2014

1.     Material:

-          Tubos capilares de vidrio de 7 a 7’5cm de longitud y 1mm de diámetro interno.

-          Plastilina

-          Gasas

-          Una centrífuga de microhematocrito. Se aplica una fuerza centrífuga de 12.000 a 15.000g durante un tiempo controlado automáticamente.

-          Una regla milimetrada o un lector de microhematocrito.

2.     Reactivos:

EDTA tripotásico dispuesto en tubos.

3.     Muestra:

Sangre capilar o venosa. La sangre venosa debe ser recogida en tubos con EDTA tripotásico. Si se utiliza sangre capilar, se ha de desechar la primera gota obtenida tras la punción.

4.     Desarrollo:

1º. La determinación ha de hacerse por duplicado

2º. Llenar cada tubo capilar con sangre, hasta las ¾ partes de su longitud. El llenado se realiza por capilaridad y se realiza poniendo en contacto uno de los extremos del tubo capilar con la gota de sangre.

3º. Limpiar el exterior de cada tubo con una gasa.

4º. Sellar el extremo de cada tubo por el que ha entrado la sangre con plastilina. Se hace penetrando el tubo en la plastilina, o incluso se atraviesa ésta con aquél.

5º. Colocar equilibradamente los tubos en la centrífuga. En ella los tubos se sitúan con su extremo tapado hacia afuera, ajustados al borde exterior y adecuadamente encajados en sus surcos.

6º. Centrifugar los tubos a unas 12.000g durante 5 minutos.

5.     Fundamento:

El HCT puede determinarse por métodos manuales o por métodos automáticos.

Los métodos manuales consisten en la centrifugación de la sangre, aplicándole una fuerza de 2.000 a 5.000 g (macrométodo) o de 12.000 a 15.000 g (micrométodo)

Los métodos automáticos pueden basarse en dos principios:

·         El cálculo matemático del HCT a partir de los valores de RBC y de volumen corpuscular medio, obtenidos electrónicamente.

·         El análisis de la sombra que produce la población eritrocitaria, al reflejarse en un campo oscuro.

Con los métodos manuales también cuentan los volúmenes de los leucocitos, de las plaquetas y el del plasma que queda atrapado entre los hematíes. Por ello, el HCT conseguido por método automático es más exacto.

6.     Resultado:

El resultado puede obtenerse midiendo las columnas formadas en el interior de cada tubo con una simple regla milimetrada y calculando el porcentaje que le corresponde a la columna de eritrocitos, mediante una sencilla regla de tres.

También puede obtenerse mediante un lector de microhematocrito.

1º. Situamos el capilar en la ranura, con la columna de eritrocitos hacia el punto rojo.

2º. Girar el disco central hasta hacer coincidir:

-          La línea más alejada del punto rojo, con el final de la columna del plasma

-          La línea más cercana al punto rojo, con el inicio de la columna de eritrocitos.

-          La línea central, con la interfase de separación presente entre el plasma y los eritrocitos.

3º. Leer en la escala inferior, el valor de hematocrito.

Entre los valores obtenidos con los dos tubos no debe hacer una diferencia superior al 2% del mayor de ellos. Si la diferencia es mayor, se repite la determinación, y si es inferior, se da como valor final del HCT a la media de ambos valores.

7.     Interpretación:

La práctica ha ido bien, pues la centrífuga separó de manera excelente nuestra muestra de sangre capilar. Se apreció claramente el plasma de los elementos formes. La medida del microhematocrito se hizo por ambos métodos y la media de los dos fue válida.

El valor normal del HCT está comprendido entre 42 y el 47% en las mujeres, y entre el 45 y el 52% en los varones.

Un valor bajo del HCT suele ser signo del padecimiento de una anemia. Un valor alto del HCT suele ser signo del padecimiento de una poliglobulina.

Ejercicios:

1.)    ¿Qué significa la franja roja que tienen algunos capilares de microhematocrito?

Significa que la sangre está heparinizada.

2.)    ¿A qué fuerza relativa de centrifugación (g) se centrifuga la sangre?

Se centrifuga a unos 12.000 g

3.)    Si con un capilar se obtiene un HCT de 45 y con el otro uno de 43, ¿cómo debe ser la forma de actuar ante estos resultados?

           Al ser mayor del 2% se repite la determinación.

Práctica 15. Recuento de hematíes (2º Evaluación)

Práctica 15. Recuento de hematíes. 20/11/2014

1.     Material:

-         Una pipeta diluidora de thoma para recuento de glóbulos rojos.

-         Un tubo de goma con boquilla, adaptable a la pipeta diluidora.

-         Una cámara de recuento con un retículo tipo Neubauer mejorado.

-         Un cubre.

-         Un microscopio

2.     Reactivos:

-          Líquido de dilución. El más utilizado es de Hayem, compuesto por:

·         2’5 g de sulfato sódico

·         0’5 g de cloruro sódico

·         0’25 g de cloruro mercúrico

·         100 ml de agua destilada

3.     Muestra:

Sangre capilar obtenida por punción de un dedo o sangre venosa anticoagulada con EDTA.

4.     Desarrollo:

1º. Situamos un cubre sobre el retículo de la cámara. Para que queden bien adheridos, se humedece la cámara con H20.

2º. Aspiramos la sangre hasta la señal de 0’5 o hasta la de 1.

3º. Limpiamos cuidadosamente el exterior  de la pipeta con una gasa y sin hacer bajar el nivel de sangre.

4º. Aspiramos el líquido diluyente hasta la señal 101.

5º. Desenganchamos el tubo de goma de la pipeta y homogenizamos el contenido del bulbo, sujetando la pipeta por sus extremos y agitándola suavemente en sentido horizontal durante 2 o 3 minutos.

6º. Desechamos las tres primeras gotas emitidas por la pipeta. Éstas son el líquido presente en el tubo capilar largo de la pipeta de Thoma.

7º. Depositamos la siguiente gota entre la cámara y el cubre. Se ubica en uno de los bordes no adheridos del cubre y la dejamos que penetre por capilaridad. Hay que evitar que se formen burbujas y que rebose la sangre diluida por fuera de los bordes del cubre.

8º. Dejamos reposar la sangre diluida durante unos minutos, para que las células sedimenten.

9º. Enfocamos el retículo con el objetivo de 40x y con el condensador a baja altura, y verificamos que la distribución de los hematíes es homogénea.

10º. Contamos los hematíes que hay presentes en 80 cuadrados pequeños del cuadrado grande central.

5.     Fundamento:

Para éste recuento de glóbulos rojos en cámara, se diluye la sangre en un líquido apropiado y posteriormente se deposita en la cámara de recuento. En tal cámara, se cuentan las células presentes en algunos cuadrados de uno de los retículos.

6.     Resultado:

Se cuentan los hematíes presentes en 5 cuadrados medianos del cuadrado grande central, y éste tiene 25 cuadrados medianos, así que multiplicamos por 5 la cifra obtenida en el recuento para calcular el número de hematíes que hay en un cuadrado grande. Al ser la longitud de cada uno de los lados del cuadrado grande central de 1 mm, hay multiplicar por 10 el resultado anterior para saber el número de hematíes existentes, no en 0’1 mm^3, sino en 1 mm^3. La sangre, al ser diluida, hay que multiplicar el resultado anterior por 100 o por 200 según por donde se parta la sangre. Para su cálculo empleamos la siguiente fórmula:

-          RBC = H x 5 x 10 x D

·         RBC: recuento de hematíes

·         H: Hematíes contados en 5 cuadrados medianos

·         D: factor de dilución (100 o 200)

7.     Interpretación:

La disminución del RBC se produce en anemias y su aumento se da en las policetimias. Se considera normal un RBC comprendido entre los 4 y los 5’5 millones/mm^3 en las mujeres, y entre los 4’5 y los 6 millones/mm^3 en los varones. Hemos logrado diferenciar tales cuadrados y poder realizar los ejercicios propuestos al fin. Nos ha resultado difícil comparar un cuadrado con otro y contar su interior.

Ejercicios:

1.)    ¿Qué se debe de hacer si el líquido de Hayem contiene precipitados?

Deberá ser filtrado antes de usarse.

Práctica 14. Cámara de recuento (2º Evaluación)

Práctica 14. Visualización de una cámara de recuento. 20/11/2014

1.     Material:

-          Un microscopio

-         Una cámara de recuento con un retículo de Neubauer mejorado.

2.     Muestra:

Sangre capilar o sangre venosa anticoagulada.

3.     Desarrollo:

1º. Observamos con el microscopio el retículo de la cámara de recuento:

·         Primero lo hacemos con el objetivo de menor aumento (4x)

·         Luego, con el objetivo de mediano aumento (10x)

·         Y por último, con el objetivo de gran aumento (40x)

2º. Enfocamos con el objetivo de 10x, uno de los cuadrados grandes que está situado en las cuatro esquinas del retículo. Contamos el número de cuadrados medianos contenidos en ese cuadrado grande periférico: Teniendo en cuenta que la longitud de cada uno de los lados del retículo es de 3 mm, calculamos la longitud de los lados de cada cuadrado periférico y la longitud de los lados de cada uno de los cuadrados medianos englobados en un cuadrado grande periférico. Teniendo en cuenta que la longitud del espacio comprendido entre el retículo y el cubre es de 0’1 mm, calculamos el volumen de sangre diluida que hay en la cámara de recuento montada, a nivel de: El retículo entero, un cuadrado grande periférico y un cuadrado mediano incluido en un cuadrado grande periférico.

3º. Enfocamos con el objetivo de 10x el cuadrado grande central. Contamos el número de cuadrados medianos contenidos en ese cuadrado grande central y el número de cuadrados pequeños englobados en uno de esos cuadrados medianos. Teniendo en cuenta que la longitud de cada uno de los lados del retículo es de 3 mm, calculamos: La longitud de los lados del cuadrado grande central, la longitud de los lados de cada uno de los cuadrados medianos incluidos en el cuadrado grande central y la longitud de los lados de cada uno de los cuadrados pequeños contenidos en uno de esos cuadrados medianos. Teniendo en cuenta que la longitud del espacio comprendido entre el retículo y el cubre es de 0’1 mm, calculamos el volumen de sangre diluida que hay en la cámara de recuento montada, a nivel de: El cuadrado grande central, un cuadrado mediano englobado en el cuadrado grande central y un cuadrado pequeño incluido en uno de esos cuadrados medianos.

4.     Fundamento:

Obtenemos los cálculos del procedimiento a seguir para hacer la práctica. Una cámara de recuento en la que la sangre capilar que tomamos como muestra, queda diluida en éste. Con el objetivo de pequeño aumento podemos ver A, B y C. Para calcular el volumen de sangre que hay en el retículo se multiplica los lados por la altura, obteniendo los mm^3 del volumen que se desea calcular. Para calcular la longitud de cada cuadrado se multiplican los dos lados.

5.     Resultado:

El resultado obtenido al realizar ésta serie de medidas indicadas por el libro son:

Cuando la longitud de cada uno de los lados del retículo es de 3 mm, enfocando uno de los cuadrados grandes de las cuatro esquinas, obtenemos que;

·         La longitud de los lados de cada cuadrado grande periférico es de 1 mm

·         La longitud de los lados de cada uno de los cuadrados medianos englobados en un cuadrado grande periférico es de 0’25 mm.

Cuando el espacio entre el retículo y el cubre es de 0’1 mm, obtenemos;

·         El retículo entero es de 0’9 mm al cubo.

·         Un cuadrado grande periférico es de 0’1 mm al cubo.

·         Un cuadrado mediano incluido en un cuadrado grande periférico es de 0’065 mm al cubo.

Cuando lo enfocamos al cuadrado grande central, contamos el número de cuadrados pequeños englobados en uno de esos cuadrados medianos que son 16. Cuando la longitud de cada uno de los lados del retículo es de 3 mm, obtenemos que;

·         La longitud de los lados del cuadrado grande central es de 1 mm

·         La longitud de los lados de cada uno de los cuadrados medianos incluidos en el cuadrado grande central es de 0’65 mm

·         La longitud de los lados de cada uno de los cuadrados pequeños en uno de esos cuadrados medianos es de 0’0625 mm.

Cuando la longitud del espacio entre el retículo y el cubre es de 0’1 mm, obtenemos que;

·         El cuadrado grande central es de 0’1 mm

·         Un cuadrado mediano englobado en el cuadrado grande central es de 0’0625 mm

·         U cuadrado pequeño incluido en uno de esos cuadrados medianos es de 0’000890625 mm.

6.     Interpretación:

Ha sido difícil contar todas las células de cada cuadrado. El microscopio no estaba en buenas condiciones, y por lo tanto supone que la práctica no haya salido como lo esperado. Hemos podido observar los cuadrados con claridad, diferenciarlos, y poder hacer finalmente los cálculos pedidos.